بسیاری از نشانگرهای فلورسنت با مواد شیمیایی آلی آروماتیک سنتز می شوند که برای اتصال به یک ماکرومولکول زیستی مانند (پروتئین یا اسید نوکلئیک) یا برای قرار گرفتن در یک منطقه ساختاری خاص مثل اسکلت سلولی، میتوکندری، دستگاه گلژی، شبکه آندوپلاسمی و یا هسته طراحی می شوند. همچنین نشانگرهای دیگر برای نظارت بر فرآیندهای دینامیکی و متغیرهای محیطی محلی،گونه های اکسیژن فعال و پتانسیل غشایی استفاده می شوند. رنگ های فلورسنت ،pH ، از جمله غلظت یون های فلزی در نظارت بر یکپارچگی سلولی (زنده در مقابل مرده یا آپوپتوز) ، اندوسیتوز، اگزوسیتوز، سیالیت غشاء، انتقال پروتئین،انتقال سیگنال و فعالیت آنزیمی مفید هستند. علاو ه بر این، نشانگرهای فلورسنت به طور گسترده برای نقشه برداری ژنتیکی و تجزیه و تحلیل کروموزوم در زمینه ژنتیک مولکولی استفاده می شوند.

در بخش اول این مقاله،به تاریخچه نشانگرهای فلورسنت پرداخته شد.رنگهای فلورسنت در اوایل قرن بیستم به عنوان رنگ های حیاتی برای تصویربرداری از باکتریها،تک یاخته ها و تریپانوزوم ها با میکروسکوپ فلورسنت معرفی شدند، اما تا سال 1920 که این میکروسکوپ برای اولین بار برای مطالعه اتصال رنگ در بافت های ثابت و سلول های زنده مورد استفاده قرار گرفت، استفاده گسترد های از آن مشاهده نشد. در طول 60 سال گذشته، پیشرفت ها در ایمونولوژی و زیست شناسی سلولی و مولکولی، طیف گسترده ای از آنتیبادی های ثانویه را تولید کرده و بینشی را در مورد طراحی مولکولی ردیاب های فلورسنت که در مناطق خاصی از کمپلکس های ماکرومولکولی هدف قرار می گیرند، ارائه کرده است . 

نشانگرها با توجه به ویژگی های جذب و فلورسانس، از جمله پروفایل های طیفی، طول موج های بیشینه جذب، نشرو شدت فلورسانس ساطع شده، فهرست بندی و توصیف می شوند . انتخاب نشانگر، یکی از حیاتی ترین جنبه های کار با میکروسکوپ هم کانون است و کارایی ابزار نیز باید به دقت در نظر گرفته شود تا تصاویر با کیفیت بالا تهیه شود. در بخش اول، به انواع رنگ های فلورسنت سنتی به عنوان مثال، فلورسین، مشتقات رودامین، 4 و 6 دیامیندینو- 2 فنیلیندول و غیره، رنگ های الکسافلور و رنگ های سیانین پرداخته شد. در ادامه، به سایر نشانگرهای مورد استفاده در ردیابی هدف با استفاده از میکروسکوپ هم کانون می پردازیم.